O novo capítulo foi intensivamente tratado no Pharmacopeical Forum antes de ser publicado e surgiu principalmente da necessidade de determinar requisitos técnicos e legais para o tema já que a caracterização e identificação vinha sendo claramente cobrado, principalmente nos capítulos referentes aos testes microbiológicos de contagem microbiana (61), pesquisa de patógenos (62), teste de esterilidade (71), monitoramento ambiental e monitoramento de sistemas de tratamento de água.
"Microorganisms, if detected in drug substances, excipients, water for pharmaceutical use, the manufacturing environment, intermediates, and finished drug products, typically undergo characterization. This may include identification and strain typing, as appropriate"
Como acontece na maioria dos laboratórios de indústrias farmacêuticas e cosméticas a caracterização e identificação de microrganismos é focada principalmente nas características fenotípicas.
- Características macroscópicas: (morfologia colonial, cor, tamanho, forma e pigmentação)
- Características microscópias: (morfologia celular, tamanho da célula, forma da célula, flagelo, material de reserva, coloração no teste de Gram ou outras e presença de esporos)
- Características fisiológicas: (tolerância ao oxigênio, faixa de pH, temperatura ótima de crescimento e salinidade)
- Características limitantes (inibição): (Sais bile tolerante, susceptibilidade antibioticos, tolerância a certos corantes.
- Quimiotaxia: perfil de ácidos graxos, toxinas microbianas, composição celular
- Ecologicas: origem
O novo capítulo trata da principal dificuldade que existe na maioria dos laboratórios farmacêuticos e cosméticos. Determinar o fluxograma ideal para caracterização e identificação microbiana.
Em linhas gerais o fluxograma é dividido nos seguintes passos sequenciais:
- Isolamento de culturas puras
- Caracterização Macroscópica
- Caracterização Microscópica (Coloração de Gram, etc)
- Caracterização Bioquímica básica (Testes de catalase, oxidase, coagulase, etc)
- Caracterização Bioquímica avançada (fermentação de açucares, pigmentos, perfil enzimático, etc)
O testes bioquímicos básicos são importantes para determinar inicialmente se o microrganismo isolado é ou não pertencente a alguns grupos, gêneros ou espécies como por exemplo; Enterobactérias (bacilos Gram negativos, oxidase negativa), Staphylococcus patogênicos (cocos Gram positivos, na forma de cachos, catalase positivo), etc.
Os testes bioquímicos avançados geralmente são realizados por kits comerciais como o BBL Crystal ou da Biomerieux que apresentam bons resultados a um custo acessível. Permitem a identificação de um grande número de espécies, mas possuem não todas. O isolamento das culturas puras e os testes bioquímicos básicos são vitais para determinar o uso correto destes kits.
A consequência mais importante com a publicação do capítulo 1113 na USP35 foi determinar que o laboratório de microbiologia não precisa realmente chegar ao nível de espécie, mas sim estabelecer um nível de caracterização aceitável que permita gerenciar o risco envolvido com o microrganismo contaminante. Obviamente o laboratório precisa estabelecer procedimentos claros de avaliação de risco, o que não é realmente uma atividade muito fácil. Principalmente dado a dificuldade de estabelecer níveis de risco aceitáveis em microbiologia.
"Routine characterization of microorganisms may include the determination of colony morphology, cellular morphology (rods, cocci, cell groupings, modes of sporulation, etc.), Gram reaction or other differential staining techniques, and certain key biochemical reactions (e.g., oxidase, catalase, Microbial characterization to this level is sufficient for many risk-assessment purposes in nonsterile pharmaceutical manufacturing operations and in some sterile product manufacturing environments. In some cases a more definitive identification of the microorganisms yields genus- and species-level identification. Beyond this, available methodologies can perform strain level identification, which can be useful in an investigation to determine the source of the microorganism".
Uma importante lição fica com a publicação do capítulo 1113, a Microbiologia Farmacêutica não é para amadores, pois as atividades de caracterização e identificação são significativamente complexas e dependem de uma boa formação e conhecimentos profundos em microbiologia. Por outro a infra-estrutura atual da maioria dos laboratórios é perfeitamente adequada para absorver estes novos requisitos sem exigir vultosos investimentos.
Boa sorte, a todos...
Paulo César P. Normandia
Coordenador de Controle de Qualidade Microbiológico
Geolab Industria Farmacêutica S/A
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